微量元素包括（微量元素包括哪些）
尽管生物制药药物具有高效能和靶向特异性，但实现治疗性蛋白质的高效生产仍然面临多种挑战。其中包括发现最大限度地表达蛋白质的新方法，开发经济、灵活且稳健的生产工艺，以最大限度地提高产品产量，以及解决将蛋白质重折叠成活性状态的复杂挑战。
行业对帮助解决这些挑战日益感兴趣的一个领域是细胞培养基和上游工艺中的微量元素。细胞培养基和添加物中的微量元素可能会在上游工艺中促进或抑制细胞生长以及蛋白质表达或质量达到不同水平。
细胞培养基中微量元素的有效浓度通常很低，在许多情况下，它们可以低于标准分析仪器的检测阈值。然而，相对于添加的量，它们的重要性却很高。许多微量金属元素在调节代谢途径和某些酶以及信号分子的活性中起着关键作用。
在CHO细胞培养中，铜缺乏可导致乳酸脱氢酶和其它线粒体氧化酶的下调，从而导致组织中毒性缺氧，而与溶解氧浓度无关因此，较高的铜浓度可以使CHO细胞的乳酸代谢从净乳酸产生转变为净乳酸消耗，从而促进细胞生长和滴度。然而，高铜浓度也可以增加抗体产物的基本异构体的相对数量。因此，CHO细胞培养基中的铜浓度应根据培养性能和产品质量仔细优化。
铁被广泛认为是化学限定培养基的必要成分。铁在通过血红素、线粒体氧化途径和其它重要酶的氧转移中起关键作用。然而，游离铁，尤其是游离铁离子，即使是微量的，也能引起高氧化应激。培养基中可加入铁载体或螯合剂，以减少毒性并改善细胞对铁的吸收。转铁蛋白是一种非常有效的铁载体，可显著影响铁的吸收，在添加血清的培养基中，转铁蛋白通常作为血清的一部分存在，而在无血清培养基中，可以添加重组转铁蛋白来改善铁的稳定性和吸收。作为转铁蛋白的廉价替代品，小分子螯合剂，如托酚酮、柠檬酸盐和亚硒酸盐也有被使用。亚硒酸盐与铁和柠檬酸盐的最佳配比表明，亚硒酸盐通过改善铁的摄取，可以促进缺铁培养基中CHO细胞的生长，并且可以提供与托酚酮相当的效果，但单独添加柠檬酸盐而不添加亚硒酸盐则没有相同的效果。然而，之后的研究表明，硫酸亚铁和柠檬酸钠的结合可以提高翻译效率和滴度。
锌是化学限定和无蛋白CHO细胞培养基中对单克隆抗体产量影响最大的微量元素之一。在商业化化学限定培养基中添加锌已被证明可以使单克隆抗体的产量提高1.2倍。此外，CHO细胞暴露于锌可导致应激蛋白功能的诱导，并随后减少凋亡。
CHO细胞培养基中主要微量元素的功能（F.V.Ritacco, et al., 2018.）
微量元素
功能
浓度
铜
支持线粒体氧化酶；调节乳酸消耗
0.8-100 μM
铁
影响产物糖基化宏观异质性；支持细胞生长和健康
10-120 μM
锌
提高单克隆抗体产量；减少细胞凋亡进程
3-60 μM
锰
改善半乳糖基化并减少产物的唾液酸化
0.4-40 μM
钼
增加生理活性物质的产生
0.001-0.1 μM
硒
促进铁的输送；保护细胞免受氧化应激和自由基的影响
0.005-0.5 μM
钒
模拟胰岛素或胰岛素类似物的代谢功能以及促进细胞生长
0.1-70 μM
钴
增加产物的N-聚糖半乳糖基化和末端蛋白的糖基化；提高在化学限定培养基中的生产力
0-50 μM
除了上面讨论的主要微量元素外，其它元素也会影响细胞生长、生产力和产品质量。这些微量元素大部分在细胞培养基中的浓度低于5 μM。众所周知，细胞培养需要锰、钼、硒和钒，因此大多数培养基中都含有这些元素。其它微量元素，包括锗、铷、锆、钴、镍、锡和铬，可能是某些哺乳动物细胞所需要的或具有某些功能，因此也会包含在某些特定的培养基中。
报导的金属离子（Fe、Cu、Zn和Mn）对生物药蛋白质关键质量属性的影响（A.T.Stone, et al., 2021）
质量属性
微量元素
影响
聚集
铁
在较低的铁浓度 (0-4 ppm) 下，螯合剂存在时，高分子量物质 (HMW)的比例显著降低。柠檬酸铁铵细胞培养浓度的增加导致二聚体浓度的增加。随着细胞培养基中柠檬酸铁和柠檬酸铁铵含量的增加，高分子量物质(HMW)的增加呈小剂量依赖性。添加铵后未发现任何变化。
铜
高水平的铜诱导IgG聚集增加Cu2+离子浓度增加IgG融合蛋白FP-A的蛋白质聚集细胞培养基中过量的CuSO4会导致IgG聚集的轻微增加降低硫酸铜水平会增加IgG融合蛋白B0的单体形式
锰
改变锰浓度没有观察到变化
片段化和降解
铁
在组氨酸存在的情况下，铁增强了人IgG1的裂解，特别是在强氧化条件下
铜
随着铜离子浓度的增加，IgG1的断裂增加
电荷异构体
铁
铁通过在Fenton反应中产生活性氧增加酸性异构体水平
铜
增加Cu2+浓度提高脯氨酸氨基化水平，导致碱性电荷异构体增加Cu2+浓度降低色氨酸氧化和整体酸性物质增加Cu2+浓度增加c端赖氨酸水平，导致碱性电荷异构体
锰
Mn2+浓度的增加减少了色氨酸氧化和整体酸性物质 (Mn可能与Fe竞争以阻止Fenton化学过程)
锌
在特定浓度范围内(~40 ~ 130 μM)， Zn2+降低了酸性异构体的水平，增加了主峰Zn2+ (羧肽酶的主要辅因子) 降低 C-末端赖氨酸和整体碱性物质的水平
酰胺和脱酰胺
铁
单克隆抗体的脱酰胺化随着铁浓度的增加而增加
铜
生产培养基中较高的Cu2+水平增加了脯氨酸酰胺化水平，从而增加了碱性电荷异构体水平
糖基化
铁
铁的生物利用度决定了糖蛋白的糖基化程度。CHO细胞培养中提高铁的添加，观察到了半乳糖基化的提高增加了糖蛋白的位置占用
铜
Cu+离子已被报道为甘露糖苷酶I反应的有效抑制剂。
锰
添加氯化锰影响CHO细胞中Man5的可用性在无葡萄糖或葡萄糖限制条件下，高甘露糖含量随Mn2+水平的增加而增加
锌
添加Zn2+时，Zn2+与Mn2+的比值增加，半乳糖基化水平降低，这是由于半乳糖基转移酶活性降低Mn2+催化半乳糖从UDP-Gal到n -乙酰氨基葡萄糖的转移
尽管在CHO细胞培养基中提供微量元素至关重要，但大多数微量元素在相对高浓度时可能对CHO细胞有毒。如果培养基中微量元素的浓度处于临界状态，则由于杂质的存在或生产不当，含有某些微量元素的培养基粉末、其它原材料或细胞培养容器受到污染，可能导致性能变化或对细胞产生毒性。
了解并控制微量元素的潜在结果是一个更可预测且更受控制的稳健上游工艺。这意味着目标细胞的批次间产物产量没有变化，而且输出纯度更高。这可能会影响下游工艺，使纯化步骤尽可能简化，并有可能减少步骤数量。最终，理解和定义微量元素的目标水平意味着认识到它们在产物生产以及糖基化等过程中发挥的作用。识别微量元素水平并确保其得到充分表征将为最严格的控制奠定基础。
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参考文献：A.Prabhu, M.Gadgil, Trace metals in cellular metabolism and their impact on recombinant protein production. Process Biochemistry, 2021.A.T.Stone, V.G.Dhara, H.M.Naik, et al., Chemical speciation of trace metals in mammalian cell culture media: looking under the hood to boost cellular performance and product quality. Current Opinion in Biotechnology, 2021.F.V.Ritacco, Y.Wu, A.Khetan, Cell Culture Media for Recombinant Protein Expression in Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells: History, Key Components, and Optimization Strategies. Biotechnology Progress, 2018.
